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金属螯合蛋白纯化系统的具体使用方法
发布时间:2018-11-22 点击次数:410次
金属螯合蛋白纯化系统使用方法
对于通过AKTA纯化系统纯化,可直接连接预装柱使用:对于一般紫外检测,可通过产品附带的鲁尔接口将蠕动泵、橡胶管、鲁尔接口、预装柱、紫外检测器连接,操作简单,快捷。
①平衡
镍螯合琼脂糖凝胶柱用2~5个柱体积的初始缓冲溶液进行平衡。
建议线性流速为100cm/h。
②上样
(1)样品一般溶解于pH6~8的初始缓冲液中。提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。
(2)缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐,同时避免巯基乙醇、DTT等还原剂。
(3)常用缓冲液有10~100mM磷酸钠缓冲液、20~200mMTris-HCl缓冲液等。
(4)缓冲液中一般要加入0.15~0.5M的NaCl以消除离子交换作用。
(5)初次使用镍螯合琼脂糖凝胶时,推荐使用50mMPBS作为初始缓冲液。
③洗脱
(1)增加咪唑浓度进行洗脱是镍螯合琼脂糖凝胶常用的洗脱方法。
(2)咪唑为碱性,相应缓冲液配制后需要用HCl调节pH值。
(3)初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时,如不确定洗脱需要的咪唑浓度,推荐在初始缓冲液中加入咪唑,浓度从低
到高分别洗脱和收集重组蛋白,之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。
(4)有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以确定较佳的洗脱条件。
洗脱方法
(1)降低pH洗脱:大多数蛋白在pH6~4会被洗脱下来,缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸和磷酸盐缓冲体系。
(2)竞争性洗脱:线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度。梯度洗脱在起始缓冲液的恒定pH值下进行。
(3)螯合剂洗脱:EDTA、EGTA等螯合剂可同金属离子产生作用力,导致蛋白被洗脱下来。此法不能分离不同的蛋白,还会影响蛋白的吸附,导致融合蛋白无法挂柱。
注:降低pH洗脱和螯合剂洗脱会使得金属离子脱落,下次使用前需要重新螯和金属离子。常用的方法为竞争性洗脱。