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金属螯合蛋白纯化系统的具体使用方法
发布时间：2018-11-22 点击次数：189次
金属螯合蛋白纯化系统使用方法
对于通过AKTA纯化系统纯化，可直接连接预装柱使用：对于一般紫外检测，可通过产品附带的鲁尔接口将蠕动泵、橡胶管、鲁尔接口、预装柱、紫外检测器连接，操作简单，快捷。
①平衡
镍螯合琼脂糖凝胶柱用2~5个柱体积的初始缓冲溶液进行平衡。
建议线性流速为100cm/h。
②上样
（1）样品一般溶解于pH6~8的初始缓冲液中。提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。
（2）缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，同时避免巯基乙醇、DTT等还原剂。
（3）常用缓冲液有10~100mM磷酸钠缓冲液、20~200mMTris-HCl缓冲液等。
（4）缓冲液中一般要加入0.15~0.5M的NaCl以消除离子交换作用。
（5）初次使用镍螯合琼脂糖凝胶时，推荐使用50mMPBS作为初始缓冲液。
③洗脱
（1）增加咪唑浓度进行洗脱是镍螯合琼脂糖凝胶常用的洗脱方法。
（2）咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl调节pH值。
（3）初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时，如不确定洗脱需要的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中加入咪唑，浓度从低
到高分别洗脱和收集重组蛋白，之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。
（4）有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以确定较佳的洗脱条件。
洗脱方法
（1）降低pH洗脱：大多数蛋白在pH6~4会被洗脱下来，缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸和磷酸盐缓冲体系。
（2）竞争性洗脱：线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度。梯度洗脱在起始缓冲液的恒定pH值下进行。
（3）螯合剂洗脱：EDTA、EGTA等螯合剂可同金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。此法不能分离不同的蛋白，还会影响蛋白的吸附，导致融合蛋白无法挂柱。
注：降低pH洗脱和螯合剂洗脱会使得金属离子脱落，下次使用前需要重新螯和金属离子。常用的方法为竞争性洗脱。
