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亲和层析蛋白纯化系统操作步骤
发布时间:2018-05-17   点击次数:417次
亲和层析蛋白纯化系统是在以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。

亲和层析蛋白纯化系统操作步骤:
(1)将抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合,一般使用的层析柱,每毫升湿的微珠大约可结合2mg的抗体。将抗体与蛋白A/G微珠混合,使其成为一种稀薄的浆状。在10ml溶液总量中大约含lml微珠。轻轻振荡混匀,室温孵育1h。
亲和层析蛋白纯化系统一般用单抗或经过亲和纯化的多抗制备。可以用不同来源的抗体,包括杂交瘤细胞培养上清液、腹水或纯化的抗体溶液,由于与蛋白A/G微珠结合,可作为去除贮存缓冲液或交换缓冲液中其他物质的步骤。
如果需知道与微珠结合抗体的准确浓度,在与微珠结合之前应对抗体进行纯化。
(2)用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠缓冲液洗涤微珠2次,以3000g离心5min,或10000g离心30s。
(3)用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠重悬微珠,并取出相当于10u1微珠的混悬液。加足量的DMP至终浓度为20retool/L。
如用DMP交联,应为pH8.3以上。
(4)轻轻混匀,室温孵育30min,取出相当于10txl已偶联的微珠。
(5)用0.2mol/L乙醇胺洗涤微珠1次,以终止反应。然后用0.2mol/L悬微珠,室温孵育2h,轻轻混匀。
(6)再次洗涤后,用含0.01%硫柳汞的PBS重悬微珠。
(7)检测微珠样品与抗体结合前后的结合效率,将样品分别加入Laemmli样品缓冲液中煮沸。分别取出相当于1/Il和9btl的两种样品,在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,用考马斯亮蓝染色。结合前样品呈现重链区带而结合后样品则无,表明交连成功.

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